人參皂苷Rg1對成年大鼠腦缺血后海馬區神經干細胞的影響

摘要:目的觀察人參皂苷Rgl對成年大鼠腦缺血后海馬區神經干細胞增殖分化的影響，探討其促進神經發生的作用。方法將60只Wistar大鼠隨機分為假手術組、單純缺血組及人參皂普Rgl治療組。用Longa線栓法制作成年大鼠大腦中動脈閉塞模型。腹腔注射5-}}脫氧尿普(BrdU)標記處于增殖狀態的神經干細胞，用免疫單標及雙標免疫熒光技術觀察人參皂普Rgl對局灶性腦缺血后海馬區BrdU免疫活性及BrdU/Tuj-1和BrdU/Vimentin雙標免疫活性的影響，并計數作定量分析。結果腦缺血后海馬區存在BrdU陽性細胞分布;應用人參皂普Rgl后，上述部位及周邊腦區BrdU陽性細胞數及雙標陽性細胞明顯增多((P}0.01)。結論人參皂普Rgl能誘導海馬區神經干細胞增殖、分化，提示其具有促進神經發生的作用。

關鍵詞:腦缺血 人參皂苷 海馬 干細胞 細胞增殖

1.引言

研究發現，成年哺乳動物腦缺血后，神經十細胞(NSCs)在某些特定區域如側腦室下區(SVZ)和海馬齒狀回顆粒下層(SGZ)的增殖能力有一定程度的提高，并A能分化為一定數量的神經元，但增殖分化的細胞遠不能替代腦缺血后造成的大量神經元脫失，因此腦缺血成為人類致死、致殘的卞要疾病之一[‘}。人參皂茸Rgl是人參的卞要活性成分之一，對神經保護、增強記憶和抗衰老作用的研究已取得了一定進展。但對腦缺血后神經發生的影響研究較少。本研究利用成年大鼠腦缺血模型，觀察人參皂茸Rgl對缺血后大鼠腦內海馬區NSCs增殖與分化的影響，探討其對神經促進發生的作用，為臨床應用人參皂茸防治缺血性腦血竹疾病提理論依據。

2.材料與方法

2.1動物分組及模型制作健康成年Wistar大鼠60只，雌雄不拘，由隴和醫科大學遺傳所提供，合格證號:SCXK(京))2002-0006。分設假手術組、單純缺血(缺血)組和人參皂茸Rgl治療(治療)組。每組20只。根據Longa線栓法制作大鼠右側局灶性腦缺血模型。術中常規檢測肛溫，保持在(37.0士0.5)0C。大鼠術畢清醒后，觀察其行為變化，按Longa評分標準將大鼠的行為變化分為5級。將1, 2, 3級定為模型成功大鼠，0, 4級棄去。假手術組:只插線10 mm，不行其他條件十預。將各組大鼠又分為缺血后1, 3, 7, 14天4個時間點。每個時間點5只大鼠。治療組術前5天腹腔注射人參皂茸Rgl(20mg/kg) > 2次//d o假手術組注射相同劑量的生理款水。

2.2主要試劑

人參皂茸Rgl由內蒙占康源藥業有限公司提供(批號:ZZ-5802一內衛藥準字(1999)1787號，規格:350mg/lOml);一抗為鼠BrdU單克隆抗體及抗兔Tuj-1, Vimentin多克隆抗體;SABC試劑盒、FITC羊抗兔IgG及TRITC兔抗羊IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。2.3 BrdU標記的增殖細胞用胸腺哈陡脫氧核有類似物BrdU標記處于增殖狀態的NSCs。采用脈沖標記，各實驗組大uw從處死前24 h開始，腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，每3h 1次，共4次，末次注射后10h處死大鼠。

2.4免疫組織化學及免疫熒光染色大鼠在麻醉后開胸，經升卞動脈插竹，先用生理欲水150 ml快速沖洗，繼而灌注4%多聚甲醛250 ml}灌注完畢后取腦，在40C下將腦移入4%多聚甲醛固定6h，然后移入30%蔗糖液中直到沉底。行冠狀切面冷凍切片，片厚15}tno

2.4.1單標免疫組織化學BrdU檢測首先需要進行DNA變性。切片入50%甲酞胺/2XSSC} 650C溫箱2 h} 2 mol/L HCl 370C30min，使DNA變性。經0.01 mol/L的TBS漂洗后加入鼠單克隆抗BrdU抗體，40C過夜。采用SABC法染色，切片置入葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳胺溶液顯色，光鏡下胞核呈紫藍色為陽性結果。

2.4.2雙標免疫熒光染色切片經冷內酮固定2030 min， 50%甲酞胺/2XSSC} 650C溫箱2 h} 2mo1/L HCl 370C30min， 1%BSA(含0.3%Tri-tonX-100的0.01 mol/L TBS配制)，370C30 min，行雙標免疫熒光標記，切片分別加兔抗Tuj-1, Vimentin抗體40C孵育過夜，FITC標記IgG(1:100)370C孵育30 min后，再加一抗鼠單克隆抗BrdU抗體(1:200)4 0C孵育過夜，然后加TRITC標記IgG(1:100)370C孵育30 min，日一油緩沖液封固。用Radi-ance 2100TM型激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。

2.5圖像分析

免疫組織化學BrdU的陽性表達分別為各自染色條件下結構完整、定位明確、著色較深的細胞及細胞核。切片在(X 200)鏡下，隨機選取10個視野，采用C8真彩圖象分析系統(北京航空航天大學生產)對BrdU平均陽性細胞數進行測量分析計數。熒光雙標在每張切片梗死側截取10個(X 400)視野，計數平均雙標陽性細胞((BrdU+/Tuj-1+或BrdU+/Vimentin+)數。

2.6統計學方法采用SPSS 12.0軟件分析。數據計算用Cx士s)表示，兩兩比較用t檢驗，P}0.05為差異有顯著性意義。

3.結果

3.1 BrdU在腦組織的表達BrdU陽性細胞著色部位為胞核，成卵圓或橢圓形。免疫組織化學染色顯示，假乎術組見極少BrdU表達，卞要分布于SGZ及SVZ等部位。缺血組BrdU陽性細胞數日明顯增加，在臍眠體、海馬CA1區、皮質及缺血梗死區周圍等處均有分布。給予人參皂有Rg 1后，BrdU陽性細胞增多，缺血7天后陽性細胞達高峰，以SGZ處最為明顯。在臍眠體呈簇狀分布，而缺血中心區及缺血邊緣區呈散落分布。缺血14天可見BrdU陽性細胞數日急劇減少，細胞質可有少量表達(表1)

3.2免疫熒光雙標染色激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發現假乎術組未見雙標陽性細胞。腦缺血14天，雙標細胞卞要位于SGZ區和臍眠體內;雙標細胞核中心紅色為BrdU陽性，周邊呈黃色為Tuj-1或Vimentin陽性。BrdU/Vimentin雙標細胞胞核紅色深染，圓形飽滿，突起呈黃色，單個或多個突起不等;BrdU/NSE雙標細胞胞核中心深紅色為BrdU陽性，胞體及突起呈黃色為Tuj-1陽性(圖A^-F)。治療組BrdU/Tuj-1, BrdU/Vimentin陽性細胞數分別為(14.3士0.5)個/視野和X15.1士0.5}個/視野，較缺血組(7.2士0.3)個/視野和(8.9士0.4)個/視野明顯增多((P}0.01)

4.討論

免疫組織化學檢測的BrdU陽性細胞可代表增殖的神經十細胞[z]。有證據顯示[3,4]，在成年哺乳動物，SGZ存在NSCs，即在上述部位存在神經發生現象，并目能從SVZ向嗅球遷移。本研究發現，缺血后早期階段，SGZ即有BrdU「日性細胞表達，缺血7天表達最為明顯，除海馬結構區外，在缺血側大腦半球許多區域都出現了BrdU陽性細胞表達。在CA1區及皮質也有少量表達，說明腦缺血后發生了NSCs的遷移，分化成神經細胞。腦缺血損傷后，nestin, BrdU的重新表達可能有增強細胞抗損傷能力、促進損傷灶修復的作用，A能增強腦組織的抗缺血能力，有利于細胞的存活及缺血損傷后的神經再生f51

雖然腦缺血可以引起NSCs增殖，但是這種內源性的反應遠不能替代腦卒中等破壞性較大的創傷所造成的神經元或膠質細胞的脫失。因此，損傷大腦尚不能達到自我修復的程度。近年的研究發現，NSCs的增殖除受細胞內基因的調控外也可受外源性因素的調節，如生長因了}I!神經遞質等。有研究結果顯示，堿性成纖維細胞生長因了、表皮生長因了、抗炎藥物等可能具有促進腦缺血后神經前體細胞增殖的作用}}.}sl。如果我們能夠認識和控制缺血后神經前體細胞增殖、成熟、遷移并與i1 :'常細胞功能性相結合這一復雜過程，則對于臨床治療腦缺血損傷及變性疾病均有重要意義[U

本實驗結果發現人參皂有Rgl能促進腦內缺血區BrdU的表達。從缺血刺激大約1天后BrdU陽性細胞開始明顯增多，于缺血后7天最為活躍，至14天時N義增殖己明顯減弱。從。與假乎術組同一部位比較，各時間點BrdU陽性細胞數明顯增多，組間比較有顯著性差異。實驗結果提示，人參皂苷有Rgl對腦缺血后BrdU表達有增強作用，能促進NSCs的增殖，同時陽性細胞表達范圍增多，說明也能促進NSCs的遷移[10}。這在神經可塑性和腦損傷后的修復中可能起著重要作用。本研究雙標免疫熒光染色結果顯示，局灶性腦缺血后14天，缺血側出現BrdU/Tuj-1, BrdU/Vimentin雙標陽性細胞，治療組雙標陽性細胞數量明顯增多，提示人參皂有Rgl能夠促進增殖細胞分化為神經元和星形膠質細胞。上述結果表明人參皂有Rgl對成年大鼠腦缺血SGZ神經十細胞有促進增殖、遷移及分化的作用。但NSCs增殖、遷移及分化的信號轉導機制等有待于進一步研究。