扶芳藤提取物對小鼠免疫功能的影響研究

扶芳藤提取物對小鼠免疫功能的影響研究

肖艷芬，黃 燕，王 琳，王 坤，肖 健

(廣西中醫學院微生物學與免疫學教研室，廣西 南寧 530001)

【摘 要】

目的 探討扶芳藤提取物對小鼠免疫功能的影響。

方法 通過檢測免疫抑制小鼠的臟器/體質量比值、巨噬細胞吞噬率、淋巴細胞轉化率以及血清溶血素的變化，觀察不同劑量水平的扶芳藤乙醇提取物對小鼠免疫功能的影響。

結果 中、高劑量的扶芳藤提取物可明顯提高免疫抑制小鼠的臟器/體質量比值、巨噬細胞吞噬率、淋巴細胞轉化率以及血清溶血素含量(P<0.05)。

結論 扶芳藤提取物可以增強小鼠免疫功能。

【關鍵詞】 衛矛科; 植物提取物; 扶芳藤; 免疫系統/藥物作用; 小鼠

文章編號： 1009-5519(2012)12-1768-02 中圖法分類號： R967 文獻標識碼：

扶芳藤[Euonymus fortunei(Turcz.)Hand.-Mazz.]屬衛矛科衛矛屬植物，又名換骨筋、小藤仲，《本草拾遺》稱扶芳藤能“主一切血，一切氣，一切冷，去百病。久服延年，變白，不老……”[1]。

前期研究表明復方扶芳藤合劑具有抗疲勞、增強免疫功能的作用[2-3]，但是扶芳藤作為復方扶芳藤合劑方中的君藥，目前對其藥理學與免疫學作用機制知之甚少。本研究通過建立環磷酰胺(cyclophos-phamide，Cy)所致免疫抑制小鼠模型 ，利用扶芳藤提取物 (extractof euonymus fortunei)進行干預，探討扶芳藤對小鼠免疫功能的作用機制，為臨床應用扶芳藤提供進一步的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物的制備

取扶芳藤 1 kg，加入相當于藥材 10 倍量的水，在不銹鋼鍋內煮開后1 h，過濾，保留濾液 ;藥渣再加 8 倍于生藥量的水，煮開后文火煎30 min，過濾去渣 ，合并兩次濾液 ，濃縮至相當于原生藥量的容量即1 000 mL 時 ，取出冷卻 ;然后加入 95%食用乙醇，邊加邊攪拌，直至藥液中含乙醇為80%時，放置 48 h，在24 h 內攪拌 3～4 次后，靜置 24 h，過濾去渣 ，濾液在旋轉回收器中回收乙醇至無醇時，將無醇的液體加熱，濃縮成每毫升2.0 g生藥的藥物，保留于4 ℃冰箱，使用時再用雙蒸水稀釋成所需濃度[4]。此外，本實驗所用Cy 購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司 ，批準文號：國藥準字H32026196;ConA 為美國 Sigma 公司產品 ，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)配制至100 μg/mL，置-20 ℃冰 箱保存備用;紅細胞裂解液購自上海博蘊生物科技有限公司;2%、10%綿羊紅細胞(SRBC)、10%雞紅細胞以及新鮮豚鼠血清由本教研室自備。

1.2 方法

取健康昆明種小鼠 50 只，雌雄各半，6 周齡，體質量18～22 g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK 桂2008-0003。將所有小鼠隨機分為 5 組：(1)實驗組(扶芳藤提取物加Cy);(2)對照組(Cy);(3)空白組(生理鹽水)。其中實驗組包括高、中、低3 個劑量組(高劑量組 200 mg/kg、中劑量組 100 mg/kg，低劑量組50 mg/kg)。各組小鼠分籠飼養 ，自由進食 ，喂標準顆粒 飼料，飲純凈水。本研究采用Cy制造免疫抑制小鼠模型 ：Cy按 40mg/kg 給實驗組與對照組小鼠腹腔注射 ，每天 1 次 ，共 3 d。實驗組同時給予扶芳藤提取物灌胃，按相應劑量給藥，每天1 次 ，共15 d;對照組給予生理鹽水腹腔注射。另外再取昆明種小鼠 50 只，按上述方法分組并用藥，用于血清溶血素測定試驗。

1.2.1 臟器/體質量比值測定

脫頸椎處死小鼠，稱量體質量，再分離胸腺、脾臟，稱質量后分別計算臟器指數。以臟器質量(mg)/體質量(10 g)作為脾臟和胸腺指數。

1.2.2 腹腔巨噬細胞吞噬功能測定

實驗結束前 1 d，腹腔注射淀粉溶液2 mL 作為誘導劑 ;實驗結束前 1 h，腹腔注射 10%雞紅細胞0.2 mL，處死小鼠后用 PBS 液 2 mL 洗出腹腔巨噬細胞 ，將洗出液置于載玻片上，30 min后洗滌，固定，行姬姆薩染色，油鏡下每張片計100 個巨噬細胞 ，并計吞噬雞紅細胞的細胞數 ，吞噬百分率=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/100 個巨噬細胞×100%。

1.2.3 淋巴細胞轉化試驗

取小鼠脾臟置于 2 mL RPMI1640 培養液中研磨，過200 目細胞篩，1 000 r/min 離心 10 min 后，棄上清液，用紅細胞裂解液2 mL 重懸后反應 7 min，1 000 r/min離心10 min，用RPMI1640 培養液重懸細胞，配置成 5×106mL-1細胞懸液。取96 孔細胞培養板，按每 100 μL 培養基 5×105個細胞的量鋪板;加入ConA，使終濃度為 5 μg/mL;將培養板置 CO2培養箱反應24 h后取細胞涂片，行瑞氏染色，油鏡下每張片計 100 個淋巴細胞，并計中度轉化及以上的細胞數，淋巴細胞轉化率=發生中度轉化及以上的細胞

/100 個淋巴細胞×100%。

1.2.4 血清溶血素的測定

末次給藥前 7 d 給每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2% 綿羊紅細胞(SRBC)進行免疫，末次給藥前 2 d 再次：給予0.2 mL 2% SRBC 進行再次免疫，2 d 后斷頸取血，分離血清并稀釋500倍 。另取試管 ，依次加入經稀釋的血清 0.5 mL、10%SRBC 0.5 mL、新鮮豚鼠血清 0.5 mL，并加入 45 ℃瓊脂液使瓊脂糖終濃度為1.4%，倒入小平皿并封閉，置 37 ℃水浴孵育 1 h 后計算空斑形成數量。

1.3 統計學方法

各組實驗數據以x±s表示，組間差異使用 SPSS14.0 軟件進行分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 扶芳藤提取物對小鼠臟器/體質量比值的影響

結果表明 ，空白組小鼠的脾臟指數與胸腺指數均顯著高于對照組(P<0.01)，提示小鼠免疫抑制模型的建立是成功的。在此基礎上，本研究發現，與對照組比較，低劑量組小鼠的脾臟指數和胸腺指數升高，但是兩組間差異不明顯;中、高劑量組可提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(中劑量組 P<0.05，高劑量組 P<0.01)和胸腺指數(P<0.01)。與空白組比較，低劑量組小鼠的脾臟指數與胸腺指數降低(P<0.01)，中、高劑量組小鼠的脾臟指數和胸腺指數降低但組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表 1。注：與對照組比較，aP<0.05;bP<0.01;與空白組比較，cP<0.01。

2.2 扶芳藤提取物對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

與對照組比較，中、高劑量組和空白組小鼠巨噬細胞吞噬率顯著升高(P<0.01)，但低劑量組差異無統計學意義 (P>0.05);與空白組比較 ，低、中、高劑量組小鼠巨噬細胞吞噬率顯著降低(低劑量組P<0.01，中、高劑量組P<0.05);中 、高劑量組比較差異無統計學意義 (P>0.05)，見表 2。

2.3 扶芳藤提取物對小鼠脾淋巴細胞轉化率的影響

與對照組比較，低、中、高劑量組和空白組小鼠脾淋巴細胞轉化率顯著升高(低劑量組 P<0.05，中 、高劑量組和空白組 P<0.01);與空白組比較，低劑量組淋巴細胞轉化率明顯降低(P<0.01)，中、高劑量組差異無統計學意義(P>0.05);中、高劑量組間淋巴細胞轉化率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表 3。

2.4 扶芳藤提取物對小鼠血清溶血素生成的影響

與對照組比較，中、高劑量組與空白組小鼠溶血空斑形成數顯著升高(P<0.01);低劑量組溶血空斑形成數升高，但差異無統計學意義 (P>0.05)。與空白組比較，低劑量組溶血空斑形成數明顯降低(P<0.05);中、高劑量組溶血空斑形成數升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。注：與對照組比較，aP<0.01;與空白組比較，bP<0.05。

3 討 論

隨著復方扶芳藤合劑的廣泛應用，作為該方劑的君藥，扶芳藤的作用機制也隨之受到研究者們的重視。扶芳已被證明含有較大比例的衛茅醇和扶芳藤多酚[5-6]。動物實驗表明，扶芳藤可以減少缺血再灌注兔心肌細胞Bax 蛋白的表達，升高 Bcl-2，從而抑制再灌注心肌細胞凋亡[7]。

本課題組的前期研究也發現，扶芳藤提取物可以減少大鼠缺血再灌注腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 的產生，這可能是因為扶芳藤提取物參與了缺血再灌注損傷過程的免疫調節功能[2，8]。提示扶芳藤可能通過相應免疫應答機制發揮免疫調節功能。免疫系統是保護機體免受外來感染及維持免疫穩定與監視功能的執行者，由免疫器官、免疫細胞、免疫分子3 部分構成。免疫器官的體積與質量在經受免疫抑制藥物(如Cy)作用后會因大量免疫細胞的死亡而減少。

本研究發現扶芳藤提取物可以維持脾臟指數與胸腺指數處于正常小鼠水平，表明扶芳藤提取物對維持免疫器官的質量發揮著重要的作用。機體針對外來抗原的第一道防線是天然免，其中巨噬細胞與樹突狀細胞、中性粒細胞同屬天然免疫的免疫細胞，它主要通過吞噬、消化外來病原發揮抗感染功能。

本研究發現，扶芳藤提取物可以提高免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞的功能，提示扶芳藤提取物可能通過促進吞噬細胞的吞噬能力而行使免疫保護功能。脾臟是成熟的淋巴細胞定居與執行免疫保護功能的場所，T淋巴細胞在脾臟通過識別抗原，分化增殖為效應性T 細胞繼而發揮細胞免疫功能。淋巴細胞轉化試驗可以檢測 T 淋巴細胞分化增殖的程度。

本研究發現扶芳藤提取物能提高免疫抑制小鼠的淋巴細胞轉化率，表明扶芳藤提取物參與了執行細胞免疫功能。除細胞免疫外，體液免疫是機體特異性免疫的另一組成部分，抗體是執行體液免疫的主要分子?？贵w在針對外來紅細胞的殺傷過程中又被命名為溶血素，它是衡量體液免疫功能最重要的指標。

本研究發現扶芳藤提取物能促進溶血素的生成 ，提示它可能具有提高體液免疫應答的功能。

表4 各組小鼠淋巴細胞溶血空斑比較(x±s)

3 各組小鼠淋巴細胞轉化率比較(x±s)

2 各組小鼠巨噬細胞吞噬率比較(x±s)

1 各組小鼠免疫器官指數比較(x±s)

扶芳藤提取物具有增強小鼠天然免疫、細胞免疫以及體液免疫功能的作用，這為臨床應用扶芳藤提供了理論依據。但是，由于扶芳藤提取物屬乙醇提取物，其成分比較復雜，因此，鑒別分析扶芳藤提取物的主要有效成分問題，將需要進一步的實驗去研究解決。